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ELISA - Información

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    ELISA - Información

    INTRODUCCION

    El enzimoinmunoanálisis es una de las técnicas inmunoquímicas más importantes desarrollada en los últimos años. Los inmunoensayos emplean una gran variedad de métodos para detectar y cuantificar Ag o Ac y para estudiar la estructura de los Ag. Si el ensayo es el adecuado, son muy rápidos y fáciles, rindiendo información que sería difícil obtener utilizando otras técnicas.

    El enzimoinmunoanálisis tiene aplicación en las áreas previamente cubiertas por el radioinmunoanálisis y la inmunofluorescencia. Esta última es una técnica más bien subjetiva y laboriosa; en contraste, el radioinmunoanálisis es objetivo y automatizable, pero está sujeto a una legislación restrictiva (por el empleo de sustancias radioactivas) y emplea reactivos cuyo período de conservación es en general breve. El enzimoinmunoanálisis también es objetivo y automatizable; además está exento de legislación restrictiva y los reactivos usados se conservan durante un tiempo muy prolongado. Estas consideraciones unidas al hecho de que sólo se necesita un equipo sencillo y económico, han llevado al desarrollo reciente de numerosos enzimoinmunoanálisis, muchos de los cuales son especialmente adecuados para su utilización en laboratorios pequeños y en países en desarrollo.

    A continuación se tratará sobre un tipo de enzimoinmunoanálisis conocido como análisis por enzimas fijadas a inmunoadsorbentes (ELISA). Esta técnica presenta como requisito que los Ac o los Ag se puedan ligar a una enzima y que este complejo retenga tanto la actividad inmunológica como la enzimática.
    En estos ensayos, el Ag o el Ac se une usualmente a un soporte de fase sólida para facilitar la separación de los reactivos libres y combinados. Ag y Ac se pueden unir covalentemente al material particulado, como celulosa, poliacrilamida, y que también se puede obtener una adsorción pasiva satisfactoria a tubos, perlas, discos o microplacas de nylon, poliestireno, polivinilo o polipropileno.

    Como se ha mencionado, una parte esencial del ELISA es la conjugación del Ac (o Ag) con una enzima. Es necesario que la enzima tenga actividad elevada, sea económica y obtenible en forma pura, y posea una reacción con el sustrato fácilmente mediable.

    Las enzimas consideradas hasta ahora más satisfactorias son:

    -Peroxidasa del rábano picante
    -Glucosa oxidasa
    -Beta-galactosidasa
    -Fosfatasa alcalina (FAL)

    Estas son fijadas generalmente a Ac o Ag por medio de glutaraldehído o periodato. Los conjugados así obtenidos han demostrado ser estables durante muchos meses, incluso años.

    La elección del sustrato es crítica en el ELISA. Los sustratos deben ser estables y solubles antes y después de la reacción enzimática. Los sustratos cromogénicos deben ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados después de la degradación. Los sustratos fluorogénicos, que producen un compuesto fluorescente, pueden ser ventajosos para análisis de alta sensibilidad.

    TIPOS DE INMUNOANALISIS

    Existen muchas formas de llevar a cabo un inmunoanálisis, y se los puede clasificar según varios criterios diferentes.
    Dentro de cada grupo el principio y el orden de los pasos son similares. Sin embargo, la variable a probar puede cambiar; por ejemplo, cambiando ciertas condiciones claves un ensayo puede convertirse en un método para determinar el nivel de un Ag en lugar del de un Ac. Los pasos son similares, pero los resultados del análisis son diferentes.

    METODO INDIRECTO
    Este método es ampliamente utilizado para la determinación de Ac, ya que se necesitan sólo unos pocos conjugados (p.e. Ac anti-Igs humanas marcadas con enzimas) para analizar Ac de una gran variedad de enfermedades. La técnica es la siguiente:

    1. El Ag correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego se lavan.
    2. Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las plaas se lavan nuevamente; el Ac presente reacciona con el Ag inmovilizado en la superficie de las concavidades.
    3. El conjugado de AntiIgs humana marcado con enzima se incuba en las concavidades; este reacciona con cualquier Ac 'capturado' en el paso anterior. El exceso de reactivo se lava.
    4. Se agrega el sustrato enzimatico y las placas se incuban; la velocidad de la degradacion se indica por el cambio de color, que es proporcional a la concentracion de Ac de las muestras del paso 2.
    5. Se detiene la reaccion y el color se determina en un espectrofotómetro.

    RESUMEN:
    1. Ag adsorbido a la placa
    LAVAR
    2. Añadir suero. Ac especifico se une al Ag.
    LAVAR
    3. Añadir antiglobulina marcada con enzima que se une al Ac
    LAVAR
    4. Añadir sustrato. Cantidad hidrolizada - cantidad de Ac presente.
    AGREGAR STOP

    IMPORTANCIA DEL ELISA EN EL DIAGNOSTICO CLINICO

    El ELISA puede utilizarse para el análsis de cualquier Ac siempre que el Ag adecuado se pueda inmovilizar convenientemenre en la fase sólida.

    1. Diagnóstico de enfermedades virales

    -Rubéola
    -Citomegalovirus
    -Herpes virus en RN y embarazadas
    -HIV (Ver más adelante...)

    2. Diagnóstico de enfermedades parasitarias

    -Malaria
    -Tripanosomiasis
    -Esquistosomiasis
    -Tripanosoma cruzi en fase crónica (no en la fase aguda, durante la cual el diagnóstico se efectúa por detección de parásitos en sangre!!!)

    3. Respuesta humoral en enfermedades autoinmunes

    Se desarrollaron sistemas ELISA para analizar Ac contra:
    -ADN
    -Hsitona
    -Tiroglobulina
    Y para detectar:
    -Complejos inmunes
    -Factor reumatoideo

    4. Endocrinología

    Hormonas proteicas
    -Gonadotrofina coriónica humana (HCG)
    -Hormona luteinizante
    -Hormona folículo estimulante
    -Insulina

    Hormonas esteroideas
    -Estrógenos
    -Progesterona
    -Testosterona
    -Cortisol

    5. Cuantifiicación de algunos medicamentos

    6. Detección de proteínas oncofetales

    VIRTUDES DEL ELISA
    -Bajo costo
    -Estabilidad de los reactivos
    -Seguridad
    -Sensibilidad
    -Facilidad de realización

    IMPORTANTE!!!
    -Deben controlarse para su óptima reproducibilidad mediante la inclusión de sueros de referencia positivos y negativos, y preparados de referencia de Ag analizados en forma independiente.
    -Los conjugados Ag/Ac con enzimas deben definirse en términos de actividad enzimática y propiedades inmunológicas (especificidad y afinidad del Ac).

    DIAGNOSTICO DEL SIDA
    Se utiliza un ensayo de tipo competitivo con el que se determina la presencia o ausencia de Ac anti-HIV.

    La utilidad de esta técnica no se limita sólo al diagnóstico del SIDA, ya que también es una herramienta más en la búsqueda de tratamientos contra esta enfermedad. Los agentes antivirales y Ac neutralizantes se estudian habitualmente empleando cultivos celulares de Lym T infectados con HIV-1, dado que una buena droga antiviral disminuirá la capacidad replicativa del virus en estos cultivos.

    La concentración viral en dichos cultivos se determina cuantifiacando una proteína viral (p24) por la técnica de ELISA tipo sandwich de doble Ac. Para ello Ac policlonales específicos son fijados a la fase sólida e incubados toda la noche en presencia de la muestra que contiene al Ag p24. Al día siguiente se realiza un lavado y se agrega un Ac monoclonal que detecta un sitio antigénico determinado en el p24. Este Ac monoclonal posee unido una enzima (estreptavidina-B-galactosidasa) que reacciona con un sustrato específico generando un compuesto fluorescente.

    A diferencia del ELISA clásico que detecta la formación de un compuesto coloreado, esta nueva técnica determina la intensidad de fluorescencia producida en un aparato diseñado a tal fin. Este nuevo ELISA-fluorescente presenta mayor sensibilidad y permite, en consecuencia, detectar bajas concentraciones de Ag viral en la muestra.
    -------------------------------------------------------------------------------
    Espero que les sea de utilidad. Saludos!!!
  2. Los siguiente/s 2 mancianos agradecen a In Vitro por este mensaje de gran utilidad:

    lulitasch (15-Aug-2010), Vital Signs (05-Apr-2011)

  3. 4
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    Agradecimientos
    recibidos
    #2
    Graciasssssss!!!!!


    Citar Originalmente publicado por in vitro Ver post
    introduccion

    el enzimoinmunoanálisis es una de las técnicas inmunoquímicas más importantes desarrollada en los últimos años. Los inmunoensayos emplean una gran variedad de métodos para detectar y cuantificar ag o ac y para estudiar la estructura de los ag. Si el ensayo es el adecuado, son muy rápidos y fáciles, rindiendo información que sería difícil obtener utilizando otras técnicas.

    el enzimoinmunoanálisis tiene aplicación en las áreas previamente cubiertas por el radioinmunoanálisis y la inmunofluorescencia. Esta última es una técnica más bien subjetiva y laboriosa; en contraste, el radioinmunoanálisis es objetivo y automatizable, pero está sujeto a una legislación restrictiva (por el empleo de sustancias radioactivas) y emplea reactivos cuyo período de conservación es en general breve. El enzimoinmunoanálisis también es objetivo y automatizable; además está exento de legislación restrictiva y los reactivos usados se conservan durante un tiempo muy prolongado. Estas consideraciones unidas al hecho de que sólo se necesita un equipo sencillo y económico, han llevado al desarrollo reciente de numerosos enzimoinmunoanálisis, muchos de los cuales son especialmente adecuados para su utilización en laboratorios pequeños y en países en desarrollo.

    a continuación se tratará sobre un tipo de enzimoinmunoanálisis conocido como análisis por enzimas fijadas a inmunoadsorbentes (elisa). Esta técnica presenta como requisito que los ac o los ag se puedan ligar a una enzima y que este complejo retenga tanto la actividad inmunológica como la enzimática.
    en estos ensayos, el ag o el ac se une usualmente a un soporte de fase sólida para facilitar la separación de los reactivos libres y combinados. Ag y ac se pueden unir covalentemente al material particulado, como celulosa, poliacrilamida, y que también se puede obtener una adsorción pasiva satisfactoria a tubos, perlas, discos o microplacas de nylon, poliestireno, polivinilo o polipropileno.

    como se ha mencionado, una parte esencial del elisa es la conjugación del ac (o ag) con una enzima. Es necesario que la enzima tenga actividad elevada, sea económica y obtenible en forma pura, y posea una reacción con el sustrato fácilmente mediable.

    las enzimas consideradas hasta ahora más satisfactorias son:

    -peroxidasa del rábano picante
    -glucosa oxidasa
    -beta-galactosidasa
    -fosfatasa alcalina (fal)

    estas son fijadas generalmente a ac o ag por medio de glutaraldehído o periodato. Los conjugados así obtenidos han demostrado ser estables durante muchos meses, incluso años.

    la elección del sustrato es crítica en el elisa. Los sustratos deben ser estables y solubles antes y después de la reacción enzimática. Los sustratos cromogénicos deben ser incoloros inicialmente y fuertemente coloreados después de la degradación. Los sustratos fluorogénicos, que producen un compuesto fluorescente, pueden ser ventajosos para análisis de alta sensibilidad.

    tipos de inmunoanalisis

    existen muchas formas de llevar a cabo un inmunoanálisis, y se los puede clasificar según varios criterios diferentes.
    dentro de cada grupo el principio y el orden de los pasos son similares. Sin embargo, la variable a probar puede cambiar; por ejemplo, cambiando ciertas condiciones claves un ensayo puede convertirse en un método para determinar el nivel de un ag en lugar del de un ac. Los pasos son similares, pero los resultados del análisis son diferentes.

    metodo indirecto
    este método es ampliamente utilizado para la determinación de ac, ya que se necesitan sólo unos pocos conjugados (p.e. Ac anti-igs humanas marcadas con enzimas) para analizar ac de una gran variedad de enfermedades. La técnica es la siguiente:

    1. El ag correspondiente se adsorbe a las placas de poliestireno, y luego se lavan.
    2. Las muestras a ensayar se incuban en las concavidades y las plaas se lavan nuevamente; el ac presente reacciona con el ag inmovilizado en la superficie de las concavidades.
    3. El conjugado de antiigs humana marcado con enzima se incuba en las concavidades; este reacciona con cualquier ac 'capturado' en el paso anterior. El exceso de reactivo se lava.
    4. Se agrega el sustrato enzimatico y las placas se incuban; la velocidad de la degradacion se indica por el cambio de color, que es proporcional a la concentracion de ac de las muestras del paso 2.
    5. Se detiene la reaccion y el color se determina en un espectrofotómetro.

    resumen:
    1. Ag adsorbido a la placa
    lavar
    2. Añadir suero. Ac especifico se une al ag.
    lavar
    3. Añadir antiglobulina marcada con enzima que se une al ac
    lavar
    4. Añadir sustrato. Cantidad hidrolizada - cantidad de ac presente.
    agregar stop

    importancia del elisa en el diagnostico clinico

    el elisa puede utilizarse para el análsis de cualquier ac siempre que el ag adecuado se pueda inmovilizar convenientemenre en la fase sólida.

    1. Diagnóstico de enfermedades virales

    -rubéola
    -citomegalovirus
    -herpes virus en rn y embarazadas
    -hiv (ver más adelante...)

    2. Diagnóstico de enfermedades parasitarias

    -malaria
    -tripanosomiasis
    -esquistosomiasis
    -tripanosoma cruzi en fase crónica (no en la fase aguda, durante la cual el diagnóstico se efectúa por detección de parásitos en sangre!!!)

    3. Respuesta humoral en enfermedades autoinmunes

    se desarrollaron sistemas elisa para analizar ac contra:
    -adn
    -hsitona
    -tiroglobulina
    y para detectar:
    -complejos inmunes
    -factor reumatoideo

    4. Endocrinología

    hormonas proteicas
    -gonadotrofina coriónica humana (hcg)
    -hormona luteinizante
    -hormona folículo estimulante
    -insulina

    hormonas esteroideas
    -estrógenos
    -progesterona
    -testosterona
    -cortisol

    5. Cuantifiicación de algunos medicamentos

    6. Detección de proteínas oncofetales

    virtudes del elisa
    -bajo costo
    -estabilidad de los reactivos
    -seguridad
    -sensibilidad
    -facilidad de realización

    importante!!!
    -deben controlarse para su óptima reproducibilidad mediante la inclusión de sueros de referencia positivos y negativos, y preparados de referencia de ag analizados en forma independiente.
    -los conjugados ag/ac con enzimas deben definirse en términos de actividad enzimática y propiedades inmunológicas (especificidad y afinidad del ac).

    diagnostico del sida
    se utiliza un ensayo de tipo competitivo con el que se determina la presencia o ausencia de ac anti-hiv.

    la utilidad de esta técnica no se limita sólo al diagnóstico del sida, ya que también es una herramienta más en la búsqueda de tratamientos contra esta enfermedad. Los agentes antivirales y ac neutralizantes se estudian habitualmente empleando cultivos celulares de lym t infectados con hiv-1, dado que una buena droga antiviral disminuirá la capacidad replicativa del virus en estos cultivos.

    la concentración viral en dichos cultivos se determina cuantifiacando una proteína viral (p24) por la técnica de elisa tipo sandwich de doble ac. Para ello ac policlonales específicos son fijados a la fase sólida e incubados toda la noche en presencia de la muestra que contiene al ag p24. Al día siguiente se realiza un lavado y se agrega un ac monoclonal que detecta un sitio antigénico determinado en el p24. Este ac monoclonal posee unido una enzima (estreptavidina-b-galactosidasa) que reacciona con un sustrato específico generando un compuesto fluorescente.

    a diferencia del elisa clásico que detecta la formación de un compuesto coloreado, esta nueva técnica determina la intensidad de fluorescencia producida en un aparato diseñado a tal fin. Este nuevo elisa-fluorescente presenta mayor sensibilidad y permite, en consecuencia, detectar bajas concentraciones de ag viral en la muestra.
    -------------------------------------------------------------------------------
    espero que les sea de utilidad. saludos!!!

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