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¿donde esta mi plásmido?

¿donde esta mi plásmido?

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    #1

    ¿donde esta mi plásmido?

    Hola a todos.
    Llevo varios semanas con un problema que no consigo solucionar. Estoy trabajando con plásmidos de un tamaño relativamente alto. Son 16 kb. Ya solucioné el problema de crecimiento de las bacterias que eran transformadas con este plásmido reduciendo la cantidad de antibiotico. El problema actual es que cuando extraigo el DNA plasmidico mediante miniprep casera, observo el pellet de DNA perfectamente, al medir en el espectofotómetro, me da una buena concentración, pero cuando lo corro en el gel de agarosa no veo absolutamente nada, ni en los carriles ni en el pocillo. No es problema de la electroforesis porque el marcador de Promega de 1kb se ve perfectamente. He llevado minipreps en paralelo de plásmidos de 6 Kb y todo ha ido correctamente. Tambien lo he intentado con kit comercial y el resultado ha sido el mismo.
    Me estoy planteando realizar un protocolo de extraccion de DNA para plásmidos de más de 40 Kb o bácmidos, pero sigo pensando que el problema no esta en la extracción. ¿Os ha sucedido alguna vez esto?, ¿me podeis dar alguna idea o solución?

    Gracias de antemano por todo.
    un saludo!
  2. Avatar de Laron
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    #2
    Bueno, a un compañero una vez le sucedió algo parecido, sólo que él colocó muy al fondo el peine, y entonces no le salía bien las medidas, ahora si dices que no te sale ni en los pocillos diría que podría ser un error al montar el soporte físico, porque el ADN no está migrando, aunque también pudiese ser el potencial que se le aplique, pero dices que el problema no está en la electroforesis...

    NaClu2 _/
    Estudiante de Medicina, Universidad de Panamá
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    #3
    Yo tuve ese problema...Probablemente el problema es que las bacterias que estas haciendo crecer a esa baja concentracion de antibiotico, son resistentes. No tienen plasmido, por eso no vez nada... Una solucion posible es usar unas bacterias especiales que toleran bien plasmidos de gran tamanio. Te recomiendoElectroMAX™ Stbl4™ Competent Cells de Invitrogen...
    Espero la respuesta te sirva
    Saludos
    Sebastian
  4. Avatar de Ariel152
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    #4
    Citar Originalmente publicado por sebasg Ver post
    yo tuve ese problema...probablemente el problema es que las bacterias que estas haciendo crecer a esa baja concentracion de antibiotico, son resistentes. No tienen plasmido, por eso no vez nada... Una solucion posible es usar unas bacterias especiales que toleran bien plasmidos de gran tamanio. Te recomiendoelectromax™ stbl4™ competent cells de invitrogen...
    Espero la respuesta te sirva
    saludos
    sebastian
    coincido con sebasg seguramente las bacterias ya hayan creado resistencia al antibiotico habria que probar con algo mas portente
    "THE BEST IS YET TO COME"
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    #5
    Citar Originalmente publicado por Ariel152 Ver post
    coincido con sebasg seguramente las bacterias ya hayan creado resistencia al antibiotico habria que probar con algo mas portente


    Coincido con ambos dos. Utiliza la dosis de antibiótico recomendada por el kit que estés usando o el protocolo que estés siguiendo. Si tus bacterias incorporaron el plásmido deberían tener resistencia a las concentraciones esperadas de antibiótico. ¿Que reducción le hiciste a la concentración?
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    #6
    Aprovecho tú pregunta para pregunte si consegiste solucional el problema y si tenéis experinecia trabajando con el plásmido 706-FLP, no consigo que me crezca en medio liquido y lo que me cece no corresponde con el patrón de restricción esperado...



    Gracias de antemano

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